Zmodyfikowany wirus zapalenia wątroby typu C E1 i E2 ze szczepionki mRNA indukuje odporność ochronną

Produkcja szczepionek mRNA-LNP kodujących glikoproteiny otoczki wirusa HCV

Lucyferaza zoptymalizowana pod względem kodonów i glikoproteiny otoczkowe HCV (genotyp 1a/H77C) sE1 (aa 193–351), sE2 (aa 386–660) i zmodyfikowana sE2_F442NYT Wygenerowano określoną sekwencję. HCV sE2 i sE2_F442NYT Próbki białek przesiano i porównano z miejscem wiązania glikozylacji wstawionym do F442 po traktowaniu PNGaząF w Washington University Proteomics Shared Resources (WU-PSR), St. Louis. Miejsce glikozylacji reszty F442 zmodyfikowanego sE2_F442NYT Białko obserwuje się po konstytutywnym zniszczeniu tej reszty i zmiennym zniszczeniu innych reszt asparaginy w tej sekwencji. mRNA z HCV sE1, sE2 lub sE2_F442NYT wygenerowane, oczyszczone i kapsułkowane LNP do zastosowania jako potencjalne szczepionki w tym badaniu⁸.

Zoptymalizowana pod względem kodonów lucyferaza HCV E1_{193 – 351} i HCV E2_{386 – 660} Specyficzne sekwencje z lub bez mutacji w resztach 442 i 444 w mRNA zsyntetyzowano, oczyszczono i zamknięto w LNP do zastosowania w immunizacji myszy. Etanolową mieszaninę lipidów zawierającą zjonizowane lipidy kationowe, fosfatydylocholinę, cholesterol i glikol polietylenowy-lipid szybko zmieszano z wodnym roztworem zawierającym oczyszczony celulozą N1-mΨ mRNA transkrybowanych in vitro. LNP obciążone mRNA sformułowano stosując całkowite stężenie lipidów 40 mM. Cząstki obciążone RNA charakteryzowały się wielkością, ładunkiem powierzchniowym, wydajnością kapsułkowania i zawartością endotoksyn i były przechowywane w temperaturze -80 ° C przy stężeniu RNA 1 μg / μl (w przypadku cząstek obciążonych) i całkowitym stężeniu lipidów 30 μg/μl (zarówno załadowane, jak i puste cząstki). Średnia średnica hydrodynamiczna mRNA-LNP wynosiła około 80 nm, ze wskaźnikiem dyspersji multipleksowej 0, 02–0, 06 i wydajnością enkapsulacji 95%. Preparat LNP użyty w tym badaniu jest własnością Acuitas Therapeutics (patent US 10,221,127). Do przygotowania szczepionki do immunizacji myszy użyto porcji jednorazowego użytku.

Immunizacja myszy szczepionką mRNA-LNP i prowokacja zakażenia rekombinowanym wirusem szczepionkowym

Myszy BALB/c (Jackson Lab) podzielono na pięć grup (5 myszy na grupę) i każdą grupę myszy immunizowano domięśniowo 10 μg potencjalnej szczepionki mRNA-LNP, takiej jak sE1/sE2, sE1, sE2, sE2_F442NYT, sE1/sE2_F442NYT, Lub kontroluj samochód dwa razy na dwa tygodnie. Prowokacja szczepionką przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu C jako alternatywny model jest przydatna w analizie odpowiedzi ochronnej na prowokację infekcją^8,20,23,24. Analizowano krwawienie testowe (3 dni przed immunizacją i 3 dni przed prowokacją infekcją) myszy. Zastosowanie modelu prowokacji rekombinowanym wirusem szczepionkowym (vv) / HCV w naszym badaniu zbadało biologiczne znaczenie odpowiedzi komórek T, a nie przeciwciała, jako funkcji ochrony przed infekcją prowokacyjną.

Immunizowane myszy poddano prowokacji dootrzewnowej żywym rekombinowanym wirusem szczepionkowym wykazującym ekspresję HCV E1-E2-NS2._{134 – 966} lub HCVE2-NS2-NS3_364-1619 (genotyp 1a/H77C) i uśmiercono 4 dni po prowokacji infekcją w celu zebrania jajników do dalszej analizy. Jajniki homogenizowano, trzykrotnie zamrażano i odwirowywano. Klarowny supernatant rozcieńczano seryjnie w celu zmierzenia miana wirusa szczepionkowego w teście tworzenia łysinek na pojedynczej warstwie komórek BSC-40. Po 3 dniach łysinki barwiono 1% fioletem krystalicznym i policzono.

Oświadczenie moralne

Wszystkie doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z odpowiednimi przepisami lokalnymi, stanowymi i federalnymi. Badania zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Uniwersytetu Saint Louis.

Oszacowanie ilości cytokin

Analizowano krwawienie testowe (3 dni przed immunizacją i 3 dni przed prowokacją infekcją) myszy doświadczalnych. Cytokiny w surowicy, IL-2 (Sigma, RAB0287), IFN-γ (R&D Systems, DY485), IL-4 (Biolegend, 431101) i IL-10 (Invitrogen, 88-7105-22) mierzono z immunizacji. Myszy poddano lizie za pomocą testu ELISA przy użyciu dostępnych w handlu zestawów zgodnie z instrukcjami producenta i wytycznymi dotyczącymi rozcieńczania. Podobnie, mysie IL-2 (Sigma, RAB0287), IFN-γ (R&D Systems, DY485) i granzym B (R&D Systems, DY1865) oznaczano ilościowo z homogenatów jajników szczura po prowokacji infekcją rekombinowanym wirusem szczepionkowym.

Test neutralizacji pseudocząstek HCV

Cząsteczki HCV pseudomonas (HCVpp) wytworzono przez kotransformację komórek HEK293T wektorem pakującym HDM-Hgpm2-pRC-CMV-Rev1b-HDM-tat1b, plazmidem Luciferase-IRES-ZsGreen (BEI Resources) i plazmidami eksprymującymi E1E2 z HCV filotypy Genomowe 1a (H77C), 1b (1b58), 3 (3.1.2) i 4 (4.1.2) są dostępne w naszym laboratorium lub zostały uzyskane od Justina Baileya (Johns Hopkins University School of Medicine, MD, USA) przy użyciu Lipofectamine 3000 (Invitrogen L3000-008)²³. Supernatanty zawierające HCVpp zebrano 72 godziny po transfekcji i przesączono przez membranę nitrocelulozową o wielkości porów 0,45 µm. Do testu neutralizacji HCVpp, 1,5 x 10⁴ Huh 7,5 komórek na studzienkę wysiano na 24-studzienkową płytkę do hodowli tkankowych i inkubowano przez noc w 37°C. Następnego dnia HCVpp zmieszano z lub bez różnych seryjnych rozcieńczeń (1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600, 1:2400, 1:3200) immunizowanej surowicy mysiej i inkubowano przez 1 godzinę w 37°C przed dodaniem do komórek Huh7.5. Po 72 godzinach w 37°C komórki poddano lizie buforem do lizy komórek (EI53A, Promega) i do każdej studzienki dodano 100 μl substratu lucyferazy (EI51A, Promega). Aktywność lucyferazy mierzono we względnych jednostkach luminescencji (RLU) przy użyciu scyntylometru Glomax (Promega). Pseudotypowane stężenie hamujące neutralizację infekcji (IC50) zdefiniowano jako zmniejszenie aktywności lucyferazy o ≥ 50% przy użyciu następującego wzoru⁶. Procent zobojętnienia obliczono jako[1 − (RLU_mAb/RLU_untreated)]× 100, ze średnimi wartościami RLU nietraktowanej kontroli w trzech powtórzeniach. Aktywności neutralizacji przedstawiono z rozcieńczeniami próbek surowicy stosując dolną i górną granicę (hamowanie 0% i 100%).

Odpowiedź immunoglobulin swoista dla podklasy lub homotypu

Płytki Nunc MaxiSorp ELISA opłaszczano 1 μg/ml oczyszczonych białek HCV E1E2 (Chiron) w 50 μl 0,1 M wodorowęglanu sodu (pH 7,2) przez noc w temperaturze 4°C. Studzienki zablokowano 2,5% roztworem buforu BSA/PBS przez 2 godziny w 37°C i przemyto czterokrotnie 0,01% Tween 20 w PBS. Mysią surowicę rozcieńczono seryjnie (1:50, 1:100, 1:200) w roztworze blokującym, dodano do płytki i inkubowano przez noc w 4°C, a następnie przemyto. Różne mysie anty-mysie immunoglobuliny znakowane króliczym HRP (podklasa: IgG, IgM, IgA; izotyp: IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3) (Bio-Rad, Mouse Typer Isotyping Panel, 1722055) dodano do odpowiednich studzienek i inkubowano przez jedną godzinę w temperaturze 37°C, po czym następuje cztery przemywania. Koniugat HRP dodano w 1:3000 i inkubowano przez 1 godzinę, po czym powtórzono cykl przemywania. Następnie dodano 100 μl roztworu substratu peroksydazy i reakcję zatrzymano 2 M kwasem siarkowym. Absorbancję mierzono przy 450 nm stosując czytnik płytek ELISA (Tecan).

Interakcja peptydów specyficznych dla otoczki HCV

Specyficzne dla peptydu wiązanie IgG w surowicy badano za pomocą testu ELISA z 18-merowymi peptydami E1 (aa 314–331), E2 (aa 404–421) i E2 (aa 429–446) szczepu HCV H77 (NR4062 i NR4063, BEI) Resources) reprezentujących konserwatywne epitopy neutralizujące specyficzne dla genotypu Variegated^{9,10,12I13I1415}. Peptyd domeny fuzyjnej SARS-CoV-2 zastosowano jako niepowiązaną kontrolę. Studzienki pokryto 500 ng peptydu i przeprowadzono test ELISA stosując różne rozcieńczenia (1:200, 1:400, 1:800) immunizowanej surowicy myszy, jak opisano powyżej.

Analiza statystyczna

Wszystkie dane zostały przeanalizowane przy użyciu oprogramowania GraphPad Prism 7. Analizę danych przeprowadzono tylko z dwiema grupami, stosując jednostronny lub niesparowany test U Manna-Whitneya R-Egzamin. Jednokierunkową ANOVA z testem Kruskala-Wallisa zastosowano do wielokrotnych porównań parami między grupami. Wszystkie dane wyrażono jako średnią ± SD (odchylenie standardowe średniej) i S<0,05 uznano za istotne statystycznie.

Podsumowanie raportów

Więcej informacji na temat projektu badawczego można znaleźć w podsumowaniu raportów z badań przyrody, do którego link znajduje się w tym artykule.