Naukowcy wytwarzają białko receptora koronaawirusa w komórkach myszy

UPTON, Nowy Jork – Zespół naukowców z Narodowego Laboratorium Brookhaven Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych i Uniwersytetu Columbia zademonstrował sposób wytwarzania dużych ilości receptora, z którym wiąże się SARS-CoV-2, wirus wywołujący COVID-19. Na powierzchni ludzkich komórek. To wiązanie pomiędzy cieszącym się złą sławą białkiem wirusa a ludzkim receptorem ACE2 jest pierwszym etapem infekcji wirusowej. Wytwarzanie funkcjonalnego ludzkiego białka ACE2 w komórkach myszy daje naukowcom nowy sposób badania i potencjalnego wykorzystania tych receptorów. Ponadto, jak opisano w artykule opublikowanym właśnie w czasopiśmie Journal of Virology, metoda ta może ułatwić badanie innych złożonych białek, które okazały się trudne do wytworzenia innymi sposobami.

Początkowym celem naukowców z Brookhaven na początku pandemii było wyprodukowanie dużych ilości ludzkiego ACE2, a następnie przyłączenie białka do nanocząstek. Nanocząstki pokryte ACE2 można następnie testować jako leki przeciwwirusowe i/lub jako czujniki do wykrywania cząstek wirusa.

„Do każdego z tych zastosowań potrzebne są duże ilości białka, a białko musi być w pełni funkcjonalne” – powiedział wirusolog z Brookhaven Laboratory. Pawła Freimuthaktóry kierował badaniami we współpracy z naukowcami z Brookhaven Lab Centrum Nanomateriałów Funkcjonalnych (CFN). „Jednak wytwarzanie funkcjonalnych białek błonowych, takich jak ACE2, jest szczególnie trudne, ponieważ proces lokalizacji białek w błonie komórkowej jest złożony”.

Jednym z powodów jest to, że białka te są modyfikowane na różne sposoby po ich wytworzeniu i przed wprowadzeniem do błony komórkowej. W szczególności cząsteczki węglowodanów dodawane do białek odgrywają kluczową rolę w procesie składania długiego łańcucha białka w jego ostateczną trójwymiarową strukturę i funkcjonowaniu białka w błonie.

„Węglowodany stanowią około jednej trzeciej masy białka ACE2” – powiedział Freimuth.

Najprostszym komórkom, których naukowcy używają do sztucznego wytwarzania białek, czyli bakteriom, brakuje enzymów potrzebnych do wiązania dodatków węglowodanowych. Dlatego zespół Brookhaven zwrócił się ku komórkom myszy, które jako ssaki są do nas bardziej podobne i dlatego są w stanie przetwarzać węglowodany w ten sam sposób. Wiadomo, że komórki myszy są biegłe w wychwytywaniu i ekspresji „obcych” genów. Chociaż komórki myszy wytwarzają również receptor ACE2, mysia wersja tego białka nie jest powiązana ze skokami wirusa SARS-CoV-2. Oznacza to, że naukowcy będą mogli łatwo stwierdzić, czy komórki myszy wytworzyły ludzkie białko ACE2, sprawdzając, czy kolce przyczepią się do komórek.

Znajdź i ekspresjonuj gen ACE2

Aby zwiększyć szanse na to, że komórki myszy włączą ludzki gen ACE2 i prawidłowo go odczytają, grupa wykorzystała nienaruszony gen. Oprócz sekwencji DNA, które kodują elementy budulcowe aminokwasów tworzących białka, geny ludzi i innych „organizmów wyższych” zawierają wiele informacji. Te dodatkowe informacje pomagają regulować strukturę i funkcję genów w chromosomach komórki.

Naukowcy przeszukali biblioteki sklonowanych fragmentów DNA powstałe w ramach projektu Projekt kodu genetycznego człowieka— sponsorowane przez Departament Energii wysiłki mające na celu zlokalizowanie wszystkich genów, które czynią nas ludźmi — znalezienie fragmentu zawierającego nienaruszony gen ACE2 wraz z osadzonymi w nim informacjami regulacyjnymi. Następnie wystawili komórki myszy na działanie nanocząstek pokrytych tym fragmentem DNA, a także genem innego białka, które czyni komórki odpornymi na śmiercionośne antybiotyki.

„W tym przypadku nanocząstki pełnią rolę środka dostarczającego DNA pochłaniane przez komórki, dzięki czemu DNA może zostać zintegrowane z chromosomami komórki myszy” – powiedział Freimuth. „Aby znaleźć komórki, które przyjęły obcy gen(y), do hodowli komórkowych dodajemy antybiotyk. Komórki, które nie przyjęły i nie wyraziły genu oporności na antybiotyki, obumierały, podczas gdy komórki, które nabyły oporność na antybiotyki, przeżyły i wyrosły w kolonie .”

Naukowcy rozwinęli około 50 z tych kolonii w pojedyncze hodowle, a następnie przetestowali je, aby określić, ile komórek również pobrało ludzki gen ACE2 i wyprodukowało ludzki receptor.

Wykrywanie produkcji białek

„Około 70% kolonii opornych na antybiotyki wykazywało ludzkie białko ACE2 na powierzchni komórek” – powiedział Freimuth. „Dalsza analiza wykazała, że ​​kolonie te zawierały średnio 28 kopii ludzkiego genu ACE2”.

Co ważne, komórki myszy zachowały kopie „obcego” genu ACE2 i nadal wytwarzały ludzkie białko ACE2 kodowane przez te geny przez co najmniej 90 pokoleń komórek.

Poziom ludzkiego białka ACE2 wytwarzanego przez komórki był na ogół proporcjonalny do liczby kopii genu ACE2 zintegrowanych z genomem myszy. Kilka klonów komórek mysich wytwarzało około 50 razy więcej ACE2 niż zwykle w komórkach myszy.

Naukowcy wykorzystali różne metody do sprawdzenia, czy ludzkie białka ACE2 wytwarzane na myszach są skuteczne. Eksperymenty te obejmowały wykazanie, że „pseudowirus” zawierający białko kolczaste Covida – niepatogenny wariant SARS-CoV-2 – może wiązać się z receptorami i infekować komórki.

„Testy infekcji wykazały, że ludzkie białko ACE2 obecne w komórkach myszy jest w pełni funkcjonalne” – powiedział Freimuth.

Zastosowania i efekty

chwila, Oleg Gang I Feiyu TengWspółautorzy badania z CFN badali różne sposoby tworzenia nanopęcherzyków zewnątrzkomórkowych wzbogaconych chimerycznym ludzkim ACE2 do potencjalnego leczenia COVID-19. Badają także umieszczenie białek ACE2 na nanocząsteczkach pod kątem potencjalnych zastosowań w leczeniu infekcji lub szybkim wykrywaniu wirusów.

„Wyzwaniem stojącym przed nanopęcherzykami na bazie ACE2 jest wzmocnienie ich działania neutralizującego wobec SARS-CoV-2. Poszukujemy również sposobów na ulepszenie i wykorzystanie czułości i swoistości wiązania nanopęcherzyków skoniugowanych z ACE2, aby uczynić je użytecznymi w walce z wirusami, ” powiedział Teng, pracownik naukowy CFN, który intensywnie pracował nad biologicznymi aspektami tego badania i potencjalnymi zastosowaniami opartymi na nanonauce: „Oba podejścia będą wymagały przyszłych udoskonaleń”.

„Jesteśmy podekscytowani możliwością połączenia postępów w wytwarzaniu nanomateriałów z podejściami biomolekularnymi w celu opracowania nowych strategii terapeutycznych i sensorycznych” – powiedział Zhang, który ma wspólne spotkanie na Uniwersytecie Columbia. „To badanie pozwoliło nam przezwyciężyć pewne problemy metodologiczne, ponieważ nanomateriały i systemy biologiczne wymagają bardzo różnych podejść do charakteryzacji. To, czego się tutaj nauczyliśmy, jest ważne dla naszych kolejnych kroków w kierunku udoskonalania bioczujników opartych na nanocząsteczkach”.

Oprócz umożliwienia możliwych zastosowań rekombinowanego białka ACE2, prace pokazują także nowe podejście do wytwarzania szerokiej gamy złożonych białek. Przykłady obejmują szeroką gamę receptorów na powierzchni komórki, które pośredniczą w niezliczonych procesach biologicznych i patologicznych, a także białka o znaczeniu przemysłowym, takie jak przeciwciała monoklonalne i enzymy.

„Nasza metoda wykorzystania nienaruszonych genów w połączeniu z komórkami myszy, które można przystosować do wzrostu w ogromnych kulturach zawiesinowych – podobnie jak kultury w płynnym bulionie stosowane do hodowli bakterii – może zwiększyć produkcję tych i innych ważnych białek na dużą skalę” – powiedział Freimuth. .

Badania te zostały wsparte grantem badawczo-rozwojowym skierowanym do laboratorium oraz zasobami wykorzystanymi przez Centrum Nanomateriałów Funkcjonalnych (CFN) w Brookhaven National Laboratory. CFN jest narzędziem użytkownika Departamentu Nauki, wspieranym przez Biuro ds. Nauki (BES).