Badanie wykazało, że ACE-2 nie jest biochemicznie wymagany do fuzji błon SARS-CoV2.

Badanie zostało opublikowane w bioRxiv* Serwer Prepress przetestował hipotezę, że ciężki ostry zespół oddechowy koronawirusa 2 (ACE-2) receptor enzymu konwertującego angiotensynę 2 (SARS-CoV-2) jest nie tylko czynnikiem wiążącym w infekcji wirusowej, ale także odgrywa rolę w aktywacji białek kolców wirusa Aby ułatwić fuzję membran.

tło

SARS-CoV-2 infekuje ludzkie komórki za pomocą receptora ACE-2 gospodarza. Wirusowe białko kolce kontroluje wnikanie wirusa SARS-CoV-2 i infekcję, ponieważ wiąże się z receptorem ACE-2 na powierzchni komórki ludzkiej. ACE-2 jest aktywowany przez rozszczepienie proteolityczne i napędza fuzję między błoną komórkową a otoczką wirusa.

Poszlakowe dowody z badań sugerują, że ACE-2 może nie tylko działać jako czynnik wiążący, ale może również pomóc w aktywacji białka fuzyjnego błony SARS-CoV-2. Lepsze zrozumienie roli ACE-2 w fuzji błonowej może pomóc wyjaśnić mechanizm leżący u podstaw infekcji SARS-CoV-2 i przewidzieć przyszłą ewolucję SARS-CoV-2 i innych podobnych wirusów.

badania

W tym badaniu naukowcy wykorzystali nici kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA), ponieważ mogą one nieodwracalnie wnikać w błony i umożliwiać programowalną samoorganizację.

Stosując to podejście, komplementarne nici DNA sprzężone z lipidami można wstawić do cząstek wirusa, tak aby syntetyczne liposomy mogły celować w cząstki bez potrzeby stosowania receptorów fizjologicznych. Katalizatory potrzebne do fuzji są następnie przekształcane chemicznie i testowane. Fuzję wykrywa się za pomocą mikroskopii świetlnej pojedynczego wirusa, w którym zmiany stanu wirusa podczas fuzji są monitorowane za pomocą barwników fluorescencyjnych. Wcześniej badacze stosowali metodę wiązania lipidów DNA, aby scharakteryzować wnikanie wirusa przez różne rodziny wirusów, w tym flawiwirusy i myksowirusy.

Naukowcy zmierzyli zależne od kolców wiązanie i fuzję w błonach syntetycznych i komórkowych, za pomocą syntetycznych liposomów, aby zapewnić brak receptora ACE-2. Trzy mutanty SARS-CoV-2 – D614G/N501Y, Wuhan i Omicron (B.1.1.529) – oraz dwie cząstki wirusowe – cząstki wirusopodobne (VLP) są wytwarzane przez ekspresję białek S, M, E i N oraz pseudowirusów na rdzeniu HIV – były używane w eksperymentach.

Zespół inkubował błony docelowe i cząsteczki wirusa oddzielnie z komplementarnymi nićmi DNA związanymi z lipidami DPPE. Zainstalowali docelowe membrany w mikroprzepływowej komorze przepływowej, umożliwiając przyleganie cząsteczek wirusa.

konsekwencje

Zdarzenia fuzji stwierdza się tylko wtedy, gdy cząstki wirusowe są przyłączone do błon docelowych i gdy obecne są proteazy. Fuzję monitorowano głównie za pomocą mieszania lipidów między błoną docelową a cząsteczką wirusa i wykrywano barwnikiem Texas Red w otoczce wirusa, co skutkowało zwiększoną fluorescencją. Wiązanie DNA za pośrednictwem wirusa-ACE-2 było specyficzne; Liczba zaadsorbowanych cząstek zmniejszyła się ponad 25-krotnie po usunięciu DNA. Podobnie nie było przypadków fuzji pod nieobecność proteaz egzogennych.

Porównując kinetykę fuzji wirusowej pseudotypowych kolców Omicron i Wuhan na rdzeniach wirusa Wuhan D614G/N501Y użytych w tym badaniu, zespół odkrył, że chociaż oba pseudowirusy wykazywały podobne szybkości fuzji, VLP skutkowały nieznacznie, ale znacznie szybszymi szybkościami fuzji.

Zaobserwowana różnica w szybkości fuzji może być spowodowana różnymi czynnikami, w tym różnicami w podwyższonej gęstości białek na VLP w porównaniu z rdzeniem HIV, białkami E i M w VLP, mutacjami D614G/N501Y oraz stosunkiem aktywnego wypustki na powierzchni VLP .

Gdy proteaza stosowana do aktywacji była zróżnicowana w doświadczeniach Omicron i Wuhan, szybkości fuzji nie były wrażliwe na stężenia proteazy w zakresie od 200 do 1000 μg/ml. Zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami, transbłonowa proteaza seryna 2 (TMPRSS2) nie była skuteczna w aktywowaniu kolców omikronowych fuzji błonowej. Jednak w przypadku cząstek D614G/N501Y dodanie 40 μg/ml TMPRSS2 skutkowało różnymi kinetykami fuzji 200 μg/ml trypsyny.

Obserwacje te sugerują, że cięcie proteolityczne może nie być etapem ograniczającym szybkość fuzji błonowej dla VLP związanych z DNA, ponieważ zmiana stężenia proteaz powinna wpływać na tworzenie kompleksu substratu enzymatycznego, a zmiany w tożsamości proteaz powinny zmieniać kinetykę fuzji.

Po jednoczesnym dodaniu rozpuszczalnego ACE-2 do proteazy zaobserwowano znaczny wzrost szybkości kinetyki mieszania lipidów w doświadczeniach ze śrubami Wuhan i Omicron. Pokazuje to, że chociaż konformację białka wypustkowego wymaganą do fuzji błonowej można osiągnąć bez ACE-2, receptor ACE-2 promuje podwyższone konformacje, które sprzyjają fuzji błonowej.

wniosek

Podsumowując, autorzy zauważają, że po aktywacji odpowiednią proteazą pseudowirusy SARS-CoV-2, jak również VLP, nie wymagają ACE-2 do włączenia do błony. Jednak dodanie rozpuszczalnego ACE-2 przyspieszyło reakcję fuzji w szczepie Wuhan SARS-CoV-2 i wariancie Omicron. Wyniki analizy kinetycznej ujawniły co najmniej dwa etapy określania szybkości fuzji błony wirusowej. Jeden z kroków był oparty na ACE-2, podczas gdy drugi nie.

Powyższe wyniki potwierdzają, że receptor ACE-2 nie jest biochemicznie niezbędny do fuzji błony SARS-CoV-2 w przypadku alternatywnego czynnika wiążącego. Ponieważ ACE-2 działa jako czynnik o wysokim powinowactwie do wiązania wirusa z komórkami ludzkimi, jego zastąpienie innymi czynnikami wiążącymi może wpływać na zdolność do ewolucji SARS-CoV-2 i środowisko sprawności wirusowej przyszłych pojawiających się koronawirusów.

*Ważna uwaga

bioRxiv publikuje wstępne raporty naukowe, które nie podlegają wzajemnej ocenie, a zatem nie powinny być uważane za rozstrzygające, ukierunkowywać praktykę kliniczną/zachowania związane ze zdrowiem lub być traktowane jako ustalone informacje.