Inhibitory układu renina-angiotensyna łagodzą popromienne zapalenie płuc poprzez aktywację osi ACE2-angiotensyna-(1-7) poprzez szlak NF-κB/MAPK.

zwierzęta

Ośmiotygodniowe samce myszy C57BL/6 otrzymano z firmy Jinan Pengyue Experimental Animal Co., Ltd. Myszy losowo podzielono na siedem grup: grupa kontrolna (n = 15); grupa napromieniania (grupa IR) (n = 15); grupa IR + związany wirus (AAV)-NC (n = 15, myszom wstrzyknięto AAV bez obciążania przez żyłę ogonową i naświetlanie klatki piersiowej przeprowadzono 3 tygodnie po wstrzyknięciu); grupa IR + AAV-ACE2 (n = 15, myszom wstrzyknięto AAV z nadekspresją ACE2 przez żyłę ogonową i naświetlanie klatki piersiowej przeprowadzono 3 tygodnie po wstrzyknięciu); grupa IR + AAV-ACE2 + A779 (n = 15, myszy, którym wstrzyknięto AAV z nadekspresją ACE2 przez żyłę ogonową, napromienianie klatki piersiowej przeprowadzono 3 tygodnie po wstrzyknięciu, A779, którym wstrzyknięto selektywnego antagonistę MasR, dootrzewnowo każdego dnia po naświetlaniu); grupa IR + kaptopril (n = 15); oraz grupa IR + walsartan (n = 15). Zwierzęta trzymano w kontrolowanej temperaturze pokojowej (22 ± 2°C) w cyklu 12/12 h ciemność/światło, dostarczając sterylną karmę i wodę. Wszystkie badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Opieki nad Zwierzętami Szpitala Prowincjonalnego Shandong (nr 2021-632). Wszystkie metody wykonano zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami. Badanie przeprowadzono zgodnie z wytycznymi ARRIVE.

eksperymentalne modele myszy

Po znieczuleniu szczury umieszczono w polu napromieniowania z całkowicie odsłoniętymi klatkami piersiowymi. Wykonano pojedyncze napromienianie klatki piersiowej 6 MV promieniami rentgenowskimi z mocą dawki 2 Gy/min w dawce 20 Gy, jak opisano wcześniej.¹⁷. Pole napromieniowania miało wymiary 40 cm x 2 cm. Wszystkie napromieniowane zwierzęta monitorowano do 5 tygodni po napromieniowaniu. AAV (2 x 10¹¹ cząsteczki wirusa/myszy) przez żyłę ogonową 3 tygodnie przed napromieniowaniem. A779 przyjmowano doustnie 2 dni przed napromieniowaniem w dawce 500 μg/kg/dobę¹⁸. Captopril przyjmowano doustnie 2 dni przed ekspozycją na promieniowanie w dawce 50 mg/kg/dobę i kontynuowano przez 5 tygodni po naświetlaniu.¹⁹. Walsartan (40 mg/kg/dzień) podawano doustnie przez 5 tygodni po naświetlaniu²⁰. Grupie kontrolnej podawano jednocześnie doustny roztwór soli.

Kolekcja próbek

Pięć tygodni po napromieniowaniu wszystkie myszy uśmiercono (przedawkowanie pentobarbitalu) i wycięto tkankę płucną. Analizy histologiczne i immunohistochemiczne przeprowadzono na tkance prawego płuca. Tkankę lewego płuca wykorzystano do analizy Western blot i ilościowego RT-PCR w czasie rzeczywistym.

Badanie histologiczne

Do oceny zmian histologicznych w tkance płuc zastosowano barwienie hematoksyliną i eozyną. W skrócie, tkanki płuc utrwalono w 10% formalinie, zatopiono w parafinie, a następnie pocięto na skrawki o grubości 5 μm (Leica, Niemcy). Następnie szkiełka odparafinowano w ksylenie, ponownie uwodniono za pomocą stopniowanej ekspozycji na etanol i wybarwiono hematoksyliną i eozyną. Na koniec skrawki obserwowano pod mikroskopem.

Barwienie immunohistochemiczne

Ekspresję IL-6 i TNF-α w tkance płucnej wykrywano przez barwienie immunohistochemiczne. Skrawki tkanki płucnej odparafinowano w ksylenie i odwodniono stosując stopniowane stężenia alkoholu. Skrawki utrwalano płynem naprawczym EDTA przez 20 minut. Następnie skrawki inkubowano z 5% BSA (AR0004, Boster, Chiny) przez 30 minut w temperaturze 37°C. Szkiełka następnie inkubowano z pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko IL-6 (1:100, #bs-0782R, Bioss, Pekin, Chiny) i TNF-α (1:100, #bs-10802R, Bioss, Pekin, Chiny) przez 4 dni °C przez noc. Po przemyciu PBS dodawano drugorzędowe przeciwciało znakowane peroksydazą chrzanową na 60 minut w 37°C. Barwienie DAB przeprowadzono w celu wizualizacji szkiełek. Dwóch doświadczonych patologów wykonało podwójnie ślepe odczyty. IL-6 lub TNF-α ulega pozytywnej ekspresji w postaci żółto-brązowych granulek na cytoplazmie i (lub) jądrze. Stosując ocenę półilościową, procent komórek dodatnich i intensywność barwienia rejestrowano pod mikroskopem. Częstotliwość komórek dodatnich określono w następujący sposób: 0, mniej niż 5%; 1, 5% do 25%; 2, 26% do 50%; 3, 51% do 75%; i 4, ponad 75%. Intensywność oceniono następująco: 0, bezbarwny; 1, jasnożółty; 2, żółto-brązowy. i 3 synów. Wskaźnik barwienia (wartości 0–12) określono przez pomnożenie stopnia intensywności barwienia przez częstość komórek dodatnich. Wskaźnik barwienia oceniono następująco: 0, negatywny (-); 1–4, słaba (+); 5-8, umiarkowane (+ +); 9-12, mocne (+++).

Wykrywanie czynności płuc

Do wykrywania zmian w czynności płuc zastosowano pletyzmografię całego ciała. Najpierw pudełko śledzące ciało zostało podłączone do czujnika na zewnątrz pudełka, a myszy umieszczono w zamkniętym pudełku, aby je wykryć. Kiedy zwierzę oddycha, oscylacja w jego klatce piersiowej zmienia głośność w urządzeniu do śledzenia ciała, a zmiana ta jest przetwarzana na sygnał elektryczny przez przetwornik ciśnienia i wzmacniacz. Po przetworzeniu przez komputer krzywa oddychania jest wyświetlana na komputerze, a obrazy są przetwarzane przez oprogramowanie w celu obliczenia parametrów oddechowych, takich jak objętość oddechowa, szczytowa prędkość wdechowa i szczytowa prędkość wydechowa.

Test immunoenzymatyczny (ELISA)

Dostępne w handlu mysie zestawy ELISA zastosowano do określenia poziomów Ang II (CK-E21284; MLBIO, Szanghaj, Chiny) i Ang-(1-7) (CK-E20733; MLBIO, Szanghaj, Chiny) w tkankach płuc zgodnie z instrukcje producenta. . Absorbancję mierzono przy 450 nm przy użyciu czytnika mikropłytek.

qRT-PCR

Całkowity RNA ekstrahowano z tkanki płuc przy użyciu TRIzolu (Vazyme Biotech Co., Nanjing, Chiny), zgodnie z instrukcjami producenta. Wyizolowany RNA transkrybowano na cDNA zgodnie z protokołem HiScript II Q RT SuperMix dla qPCR (Vazyme Biotech Corporation, Nanjing, Chiny). PCR w czasie rzeczywistym przeprowadzono przy użyciu SYBR qPCR Mix (Vazyme Biotech Co., Nanjing, Chiny). Dane obliczono przy użyciu 2^-ΔΔt droga. Każde doświadczenie przeprowadzono w trzech powtórzeniach. Starter prawy MasR 5′-ACAACACGGCCTCCTATCTG-3 i starter prawy 5′-GAAGGCACAGACGAATGCT-3, starter prawy aktyny 5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3 i starter wsteczny 5′-CCAGTTGGTAGTAAT.

Western blotting

Tkanki płuc homogenizowano w buforze do lizy RIPA (Biotime, Chiny) z inhibitorami proteazy, a następnie wirowano przy 12 000 obr./min w 4°C i zbierano supernatanty. Białka rozdzielono na 8–10% żelach poliakryloamidowych z dodecylosiarczanem sodu i przeniesiono na membrany z fluorku poliwinylidenu. Błony cięto przed hybrydyzacją z przeciwciałami. Następnie błony inkubowano z pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko ACE2 (1:1000; #bs-0439R, Bioss, Pekin, Chiny), ACE2 (1:1000, #21115-1 Ig, Proteintech, Chiny) , ATIR (1:1000 ; #bs-0630R, Bioss, Pekin, Chiny), p38 (1:500 #OM125772 OmnimAbs Chiny), p-p38 (#bs-0636R 1:1,000 Bioss), JNK (#OM260186, 1:500, OmnimAbs), p-JNK (#bs-17591R, 1:1000, Bioss), ERK1/2 (#OM125780, 1:500, OmnimAbs, Chiny), p-ERK1/2 (#bs-3016R, 1:1000, Bioss), NF-κB p65 (#66535-1-lg, 1:1000, PTG) i p-NF-κB p65 (#bs-3485R, 1:1000, Bioss) w temperaturze 4°C przez noc. Błony następnie inkubowano z drugorzędowymi przeciwciałami skoniugowanymi z peroksydazą chrzanową (1:5000, #bs0295M, Bioss, Pekin, Chiny) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Na koniec białka wizualizowano przy użyciu odczynników ECL (Millipore, USA) i analizowano za pomocą ImageJ.

Dane kliniczne

W celu dalszej weryfikacji ochronnego wpływu RAS na RP, dokonano przeglądu kolejnych pacjentów leczonych jednocześnie radioterapią klatki piersiowej z powodu niedrobnokomórkowego raka płuca w okresie od października 2017 r. do grudnia 2019 r. w naszym ośrodku onkologicznym. RP oceniano po raz pierwszy 1 miesiąc po radioterapii (RT) za pomocą tomografii komputerowej (CT), a następnie co 2 miesiące przez okres do 1 roku. Rozpoznanie RP musi spełniać następujące trzy kryteria²¹: (1) objawy płucne, w tym duszność lub kaszel, lub jedno i drugie; (2) zmiany CT obejmujące napromieniowane pole; oraz (3) objawy występujące w ciągu 12 miesięcy po zakończeniu radioterapii. To studium przypadku zostało przeprowadzone zgodnie ze standardami etycznymi Deklaracji Helsińskiej i zostało zatwierdzone przez Centralny Szpital Stowarzyszony Pierwszego Uniwersytetu Medycznego w Shandong (nr 2022-033-01). Konieczność uzyskania świadomej zgody ze względu na retrospektywny charakter badania została zniesiona przez Komisję Etyki Badań Centralnego Szpitala Stowarzyszonego Pierwszego Uniwersytetu Medycznego w Shandong.

Analiza statystyczna

Dane analizowano przy użyciu SPSS w wersji 25.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). Zmienne ciągłe przedstawiono jako średnią ± SEM i porównano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) dla wielu grup. W badaniu populacyjnym ryzyko aktuarialne rozwoju RP oszacowano metodą Kaplana-Meiera. Grupy RASi i bez RASi porównano za pomocą testu log-rank. S<0,05 uznano za istotne statystycznie.

aprobata etyczna

Wszystkie badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Opieki nad Zwierzętami Szpitala Prowincjonalnego Shandong (nr 2021-632). Wszystkie metody wykonano zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami. Badanie przeprowadzono zgodnie z wytycznymi ARRIVE.

To studium przypadku zostało przeprowadzone zgodnie ze standardami etycznymi Deklaracji Helsińskiej i zostało zatwierdzone przez Centralny Szpital Stowarzyszony Pierwszego Uniwersytetu Medycznego w Shandong (nr 2022-033-01). Konieczność uzyskania świadomej zgody ze względu na retrospektywny charakter badania została zniesiona przez Komisję Etyki Badań Centralnego Szpitala Stowarzyszonego Pierwszego Uniwersytetu Medycznego w Shandong.