Odkrywanie biologii białek jednokomórkowych

Aby sprostać wyzwaniu, jakim jest wyczerpywanie się próbek podczas przygotowywania, dokonano szeregu ostatnich zmian w szybko rozwijającej się dziedzinie badań nad SCP, z ważnym wkładem wielu badaczy. Poprzednie prace łączyły elektroforezę kapilarną (CE) ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (HRMS) w celu analizy pojedynczych białek blastomerów z Xenopus laevis zarodki¹². Ostatnio Zhou i wsp. opracował metodę o nazwie NanoPOTS (One-pot Nanodroplet Processing of Tracer Samples)¹³. Ta metoda ogranicza etapy manipulowania cieczą i zwiększa wydajność białek na komórkę, co skutkuje identyfikacją od 2 do 25 razy większej liczby peptydów niż w przypadku przygotowywania próbek w mikroprobówkach. Wykazali, że NanoPOTS solidnie zidentyfikował 1500-3000 białek z 10 do 140 komórek i zwiększył głębokość proteomiczną do ponad 3000 białek dzięki zastosowaniu algorytmu dopasowywania między seriami w oprogramowaniu MaxQuant używanym do analizy danych.¹³. Podobnie w innym badaniu podejście NanoPOTS umożliwiło identyfikację około 670 grup białek w ekstraktach pojedynczych komórek HeLa.¹⁴.

Zespół Nikolaya Slavova przyjął inne podejście, opracowując metodę o nazwie SCoPE-MS (Single-Cell Proteomics by Mass Spectrometry), która miała na celu zmniejszenie utraty próbki spowodowanej adhezją do kolumn chromatograficznych lub innych powierzchni poprzez włączenie białka nośnikowego, które zwiększa się w niewielkiej ilości. Obfitość peptydów jest przedmiotem spektrometrii mas. Warto zauważyć, że w tej metodzie próbki testowe i nośnikowe są indywidualnie znakowane znacznikami izobarycznymi, a następnie łączone, co jest trudnym technicznie krokiem w przypadku próbek o małej objętości¹⁵. Jednak próbka nośnika, która ma 200-krotnie większą obfitość białka niż pojedyncze komórki i wyznakowana pojedynczym odczynnikiem izobarycznej masy tandemowej (TMT), może indukować MS2, a tym samym umożliwia ocenę ilościową pojedynczych komórek w populacji TMT na podstawie ich jonu reporterowego.¹⁵. Analizy SCoPE-MS 12 komórek Jurkat i 12 komórek pojedynczych U-937 zidentyfikowały łącznie 767 białek¹⁵. W przypadku SCoPE-MS¹⁵podczas gdy włączenie białka nośnikowego umożliwia identyfikację większej liczby peptydów, może to negatywnie wpłynąć na ilości¹⁶. Wynika to z trudności w dokładnym oszacowaniu MS na bardzo niskich sygnałach z peptydów pochodzących z białek w pojedynczych komórkach w obecności bardzo dużych sygnałów peptydowych z białek nośnikowych.¹⁷. Aby lepiej zrozumieć to wyzwanie, Cheung i współpracownicy przeanalizowali związek między poziomem białka nośnikowego a rozdzielczością ilościową SCoPE-MS.¹⁶. Wyniki pokazały, że zwiększenie ilości białka nośnikowego wymagało odpowiedniego zwiększenia liczby próbkowanych jonów, aby zachować dokładność ilościową. Na podstawie uzyskanych wyników dostarczyli wskazówek dotyczących projektu eksperymentu SCP, gromadzenia i analizy danych oraz opracowali oprogramowanie SCPCompanion, które umożliwia analizę kontroli jakości danych SCP-MS.

Podczas gdy Cheung i in. Dyskutuje się nad potrzebą odpowiednich parametrów akwizycji MS podczas wykonywania badań SCP i pozostaje niejasne, które poziomy nadmiaru nośnika zapewniają optymalną równowagę między czułością a dokładnością lub w jakim stopniu niższe współczynniki osłabiają rozdzielczość ilościową¹⁸. Dlatego Ctortecka i in. przeprowadził kompleksowe badanie obecnie dostępnych multipleksowych technik SCP, które uwzględniają definicje białek, wariancję pomiaru, dokładność ilościową i brakujące dane. Doszli do wniosku, że ograniczenie mutacji nosicieli do -20-krotnego jest krytyczne dla dokładnych analiz SCP i że analizy DIA-TMT zapewniają lepsze nakładanie się homozygot w porównaniu z analizami DDA-TMT przy zachowaniu przepustowości akwizycji z lepszą rozdzielczością ilościową. Więcej informacji na temat DIA i DDA można znaleźć poniżej.

Ulepszony przepływ pracy, SCoPE2^{19, 20}włączono kilka ulepszeń do SCoPE-MS, które były ukierunkowane na zwiększenie dostępności, przepustowości i dokładności²⁰. Ulepszenia obejmowały (1) lizę komórek przy użyciu metody minimalnego przygotowania próbki białka (mPOP), która wykorzystuje cykl zamrażania na gorąco, który ekstrahuje białka w wodzie, unikając w ten sposób oczyszczania przed chromatografią cieczową ze spektrometrią mas (LC-MS), (2) zmniejszona objętość lizy i strawność od 10 do 1 μl, co zwiększa 10-krotnie stężenie trypsyny i białka substratu w trawieniu, (3) zastosowanie kanału referencyjnego składającego się z porcji ze wszystkich grup próbek, (4) krótszy gradient nLC co zwiększa przepustowość i czułość MS oraz (5) systematyczną optymalizację parametrów, która obejmuje optymalizacje opracowane wcześniej w celu poprawy akwizycji danych MS (np. DO-MS; optymalizacja MS oparta na danych)²¹ oraz w celu wzmocnienia identyfikacji peptydów w pozyskanych danych SCP LC-MS/MS (np. DART-ID; wyrównanie czasów retencji rozpoznawania danych)²². Jak pokazano w Specht i in. Dokładna ocena ilościowa danych LC-MS/MS wymaga pobierania próbek z wierzchołków pików chromatograficznych²⁰. Tak więc Hoffman i in. DO-MS został opracowany w celu optymalizacji parametrów instrumentu niezbędnych do umożliwienia próbkowania pików chromatograficznych, zwykle w ciągu 3 s od ich pików.²¹. Ponadto SCoPE2 poprawiło identyfikację sekwencji peptydów przy użyciu algorytmu Bayesa (DART-ID), aby uwzględnić informacje o czasie retencji, które zwiększają pewność przypisania sekwencji peptydów do widm MS/MS podczas ścisłego określania współczynnika fałszywego wykrywania (FDR).²². Wysoka czystość spektralna i zastosowanie czasów retencji w celu zwiększenia identyfikacji sekwencji peptydów umożliwiło zmapowanie sekwencji peptydów do około 35% widm MS2 z każdego SCoPE2 przy 1% FDR.²⁰.

Dodatkowe badania mające na celu poprawę przygotowania próbek obejmują prace Schoofa i in. , który opracował zoptymalizowany przepływ pracy dla zautomatyzowanego SCP. Odkryli, że dodanie 20% trifluoroetanolu (TFE) podczas hydrolizy i 10% TFE podczas trawienia trypsyną zwiększyło liczbę zidentyfikowanych białek o około 5%.⁶. Przeprowadzili także badania mające na celu optymalizację ustawień narzędzi MS dla SCP. Badania te wykazały, że czasy wstrzykiwania 300 i 500 ms zapewniają dobrą równowagę między głębokością białka a wydajnością ilościową.⁶. Wreszcie, Schoof (czytaj białka jednokomórkowe do ekspresji), pakiet Pythona, który rozszerza możliwości Scanpy do przetwarzania jednokomórkowych danych MS/MS, jest opisany przez Schoof i in.⁶. Jak wyszczególniono tutaj, https://scanpy.readthedocs.io/en/stable/Scanpy to oparty na języku Python skalowalny zestaw narzędzi do analizowania danych dotyczących ekspresji genów w pojedynczych komórkach. Scepter pobiera pliki wyników z Proteome Discoverer i informacje opisowe z poszczególnych komórek, co jest kluczową funkcją, która umożliwia Scepterowi korelację zarejestrowanych parametrów FACS z powrotem do każdej komórki. Autorzy stwierdzili, że całkowita gęstość na komórkę zapewnia odpowiedni parametr do wykrywania komórek zewnątrzkomórkowych, które mogą powstać z sparowanych par, pustych dołków lub utraty próbki podczas przygotowania. Filtrowanie takich komórek było kluczowe dla uniknięcia błędnych wniosków biologicznych⁶. Wykorzystując zoptymalizowany przepływ pracy, analiza ośmiu 384 jednokomórkowych paneli z pierwotnego systemu modelowego białaczki zidentyfikowała 2723 białka w 2035 komórkach, przy czym średnio zidentyfikowano 987 białek na komórkę.

Ograniczeniem kwantyfikacji bez etykiet zależnej od danych (DDA) jest brak wartości, które komplikują analizę nawet replik technicznych. Wyzwanie to pogarsza niski stosunek sygnału do szumu charakterystyczny dla danych SCP LC-MS/MS. Kalksdorf i in. Spróbuj stawić czoła temu wyzwaniu, opracowując przepływ pracy IceR (ponowna ocena ekstrakcji prądu jonowego), który łączy wysokie wskaźniki określania DDA z podobnie niskimi wskaźnikami brakujących wartości w pozyskiwaniu niezależnym od danych (DIA)²³. Autorzy ci zastosowali IceR do danych SCP i wykazali, że niezawodnie zwiększyło to liczbę białek zidentyfikowanych w próbkach pojedynczych komórek.

Opracowano wspomagany mikrofiltrami system przygotowywania próbek o nazwie MICROFASP, który umożliwia równoległe przetwarzanie 146 pojedynczych jąder wyizolowanych ze stadium 50-komórkowego. Xenopus laevis zarodki (∼200 ng białka/blast)²⁴. Na podstawie analiz LC-MS/MS 109 blastomerów zidentyfikowano średnio 3468 ± 229 grup białek i 14 525 ± 2437 unikalnych peptydów z każdego blastomeru, przy czym w każdym blastomerze zidentyfikowano 1311 białek.²⁴. Brunera i in. niedawno opisali również przepływ pracy z pojedynczą komórką, który łączy przygotowanie miniaturowej próbki, chromatografię o bardzo niskim przepływie (100 N/min) i nowatorską spektrometrię mas z ruchami uwięzionych jonów (TIMS), która poprawiła czułość 10-krotnie w stosunku do 1 µl/min chromatografia szybkość przepływu²⁵. Metoda, zwana prawdziwymi białkami pochodzącymi z pojedynczej komórki (T-SCP), wymaga ostrożnego obchodzenia się z próbką, w której pojedyncze komórki są sortowane do dołków zawierających 1 μl roztworu do lizy, a następnie etap ogrzewania i dodawania endopeptydazy lizylowej i trypsyny do podać łącznie 2 μl w zamknięte miejsce. Peptydy są skoncentrowane w 20 nanowiązkach w urządzeniu EvoTip podobnym do StageTip. Peptydy są następnie poddawane LC-MS/MS o bardzo niskim przepływie z nowym trybem akwizycji diaPASEF (Parallel Accumulation-Sequential Fractionation), w którym jony peptydowe są uwalniane w skoncentrowanych pakietach z urządzenia TIMS do kwadrupolowego układu czasowo-próżniowego. Spektrometr masowy w locie (TIMS-qTOF).²⁶. Te prekursory peptydów można fragmentować w bardzo czuły sposób, w trybie zależnym od danych (ddaPASEF) lub niezależnym od danych (diaPASEF), co skutkuje bardzo wysokim wykorzystaniem jonów i niskimi wskaźnikami utraty danych.²⁶. Kiedy to drugie podejście połączono z chromatografią o bardzo niskim natężeniu przepływu, autorzy zidentyfikowali do 2083 białek na komórkę HeLa przy użyciu biblioteki spektroskopii HeLa DIA.²⁵.

Wykazano, że elektroforeza kapilarna połączona z jonizacją przez elektrorozpylanie i spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (CE-ESI-HRMS) ma wystarczającą czułość do subkomórkowych analiz proteomicznych.²⁷. W tym badaniu przeanalizowano próbki, które wahały się od dużych komórek o średnicy od 250 μm Xenopus laevis Zarodki do mikroneuronów przeszczepionych o średnicy 35 μm z hipokampa myszy. Analizy około 18 ng ekstraktu z linii środkowej brzusznej zwierzęcia lub komórek równikowych zidentyfikowały 1133 białek w 16-komórkowym zarodku. Ponieważ CE-ESI-HRMS około 5 ng strawionego białka z lewej grzbietowej komórki linii środkowej zidentyfikowało 722 białka, ta technika ma wystarczającą czułość do analizy mniejszych komórek. Ponieważ jednak CE-ESI-HRMS trzech pojedynczych neuronów zidentyfikowało odpowiednio tylko 16, 14 i 7 białek, prawdopodobne jest, że ręczne obchodzenie się z tymi komórkami i obchodzenie się z nimi w mikrofiolkach spowodowało znaczne straty wychwytu. Łącznie badania te pokazują, że CE-ESI-HRMS może potencjalnie stanowić cenne uzupełnienie SCP opartych na nanoLC.

Jak podsumowano powyżej, zmniejszenie objętości próbki i trawienia do ≤2 μl, zmniejszenie wysokości nośników w multipleksowych technikach SCP do <20-krotne, uproszczenie procedur lizy komórek, zmniejszenie gradientów HPLC i/lub prędkości przepływu oraz optymalizacja parametrów akwizycji spektrometrii mas, zastosowanie czasów retencji w celu poprawy identyfikacji sekwencji peptydów, rozwój oprogramowania, które zapewnia ulepszone przetwarzanie i analizę danych SCP-MS/MS oraz wykorzystanie analiz DIA lub podobnych do DIA zamiast DDA przyczyniły się do znaczących postępów w analizach SCP w ciągu ostatnich kilku lat można teraz ilościowo oznaczać do 2000 białek w pojedynczym ekstrakcie komórkowym HeLa.