Metodologia testu immunologicznego HCV adaptacyjnego

W przypadku chorób zakaźnych diagnostyka oparta na serologii służy jako podstawowe narzędzie monitorowania i diagnozowania. Jednak nie ma dostępnych komercyjnych badań przesiewowych dla niektórych zaniedbanych chorób, które dotykają głównie kraje o niskich i średnich dochodach, ze względu na ceny związane z powszechnymi badaniami.

Niedawno opublikowane badanie wykazało rozwój i walidację multipleksowego endoskopowego testu immunosorpcji enzymatycznej (ELISA) przeciwko Wirus zapalenia wątroby typu C (HCV). Według naukowców biorących udział w badaniu, test ten można przeprowadzić niskim kosztem.

Metodologia może zapewnić łatwo adaptowalną metodę, którą można wykorzystać do opracowania nowych testów diagnostycznych opartych na ELISA dla innych patogenów zakaźnych, co może poprawić diagnostykę zaniedbanych chorób.

Rozwój antygenu MBP-HCV

Zespół naukowców, w tym Jannie Pedersen, Departament Mikrobiologii-Infekcji i Immunologii oraz Szkoła Medyczna Uniwersytetu Laval, opracował adaptacyjny test immunoenzymatyczny (ELISA) wykorzystujący HCV do weryfikacji koncepcji. Udało im się uzyskać wysokie stężenie białka odpowiednie do dalszych zastosowań po połączeniu białka wiążącego maltozę z poliklonalnym białkiem HCV.

„Po optymalizacji test został zweryfikowany przy użyciu wcześniej przetestowanych próbek ludzkich z Kanady, Danii i Gabonu równolegle z użyciem komercyjnego białka” – napisali naukowcy. „Czułość i swoistość obliczono odpowiednio na 98% i 97%, po uwzględnieniu poprawy niespecyficzności ligacji i testu”.

Zespół sklonował kilka epitopów specyficznych dla wirusa zapalenia wątroby typu C, rozdzielonych łącznikiem GS, i przeniósł je do zmodyfikowanego wektora pET28a+, który poddano fuzji z białkiem wiążącym maltozę (MBP). Antygen (MBP-HCV) w komórkach bakteryjnych BL21-DE3 stymulowano IPTG i oczyszczano za pomocą chromatografii powinowactwa do nieruchomych jonów metali.

Walidacja badania serologicznego

Wybrano próbki od pacjentów z przewlekłym wirusowym zapaleniem wątroby typu C i porównano je ze zdrowymi grupami kontrolnymi w celu usprawnienia badań przesiewowych. Badacze oszacowali, że optymalny stosunek sygnału do szumu byłby przy inaktywacji przez 3 godziny w 56°C. W tych warunkach w próbkach dodatnich zaobserwowano niewielki 17% spadek gęstości optycznej.

Jednocześnie w próbkach kontrolnych po 3 godzinach inaktywacji w porównaniu do 30 minut inaktywacji zaobserwowano 72% spadek sygnału nieswoistego od średniej gęstości optycznej 0,11-0,03. Najlepsze wyniki osiągnięto powlekając każdą studzienkę 15 ng MBP-HCV i stosując rozcieńczenie 1:100 materiału próbki.

Aby ocenić jakość naszego białka MBP-HCV, analizowano wiązanie ELISA dla tych samych próbek HCV-dodatnich i ujemnych, stosując dostępne w handlu rekombinowane białko wyrażające NS3, rdzeń, NS4 i NS5.

Podobną czułość (95% CI, 91-97%) i swoistość (96% CI, 92-98%) uzyskano przy użyciu tego komercyjnego białka. Na podstawie przedstawionych danych potwierdzono jakość białka MBP-HCV wytwarzanego wewnętrznie przez zespół i przeznaczonego do serodiagnostyki pacjentów z wirusowym zapaleniem wątroby typu C.

Sugerowana implementacja

„Tutaj dokumentujemy rozwój prostego testu serologicznego do wykrywania przeciwciał HCV. Badacze wykazali, że ten test można odtworzyć i zwalidować w laboratoriach referencyjnych w krajach o niskich i średnich dochodach, gdzie wirusowe zapalenie wątroby typu C pozostaje poważnym obciążeniem zdrowotnym.”

Według badania, gdyby lokalna produkcja testu mogła być prowadzona przez laboratoria rządowe lub organizacje non-profit, wyższe bariery kosztów dostawy, podatki importowe oraz marże zysku producentów i dystrybucji zostałyby zmniejszone lub wyeliminowane.

„Chociaż serodiagnostyka nie może być samodzielnym narzędziem diagnostycznym infekcji wirusowym zapaleniem wątroby, opracowany test ELISA jest prostą i dokładną metodą dokumentowania częstości występowania wirusowego zapalenia wątroby typu C w dużej populacji” – powiedzieli badacze. „Globalna walka o zmniejszenie zapalenia wątroby jako poważnego zagrożenia dla zdrowia będzie wymagała rozbudowanych platform badań przesiewowych, które mogą z łatwością przetestować wszystkie zagrożone populacje, a nie tylko osoby z objawami”.

badania, „Adaptacyjna platforma do badań endogennego zapalenia wątroby typu COpublikowany w Dziennik metod wirusowych.