Naukowcy z Northwestern University w USA opracowali niedawno wysokowydajną zautomatyzowaną platformę do badań przesiewowych do szybkiej identyfikacji przeciwciał SARS-CoV-2 przeciwko ciężkiemu ostremu zespołowi oddechowemu. Badanie jest już dostępne pod adresem bioRxiv* Serwer przygotowania do druku.
tło
Terapeutyczne przeciwciała monoklonalne opracowane przeciwko białku szkieletowemu SARS-CoV-2 stały się obiecującą interwencją w leczeniu pacjentów z nowym koronawirusem 2019 (COVID-19). Podobnie wykazano, że przeciwciała wytwarzane w odpowiedzi na szczepionki COVID-19 są wysoce skuteczne w zapobieganiu zakażeniom SARS-CoV-2 i chorobom objawowym. Poza zastosowaniem terapeutycznym, przeciwciała są szeroko stosowane w testach immunologicznych do szybkiego wykrywania antygenów wirusowych.
Obecnie używane platformy przesiewowe są wykorzystywane do identyfikacji przeciwciał specyficznych wobec antygenu skierowanych przez Evolution lub izolowania klonów z pojedynczych komórek B od osobników odzyskanych z COVID-19 lub zakażonych zwierząt. Izolacja, ocena i identyfikacja najlepszego kandydata na przeciwciało wymaga szeregu czasochłonnych i pracochłonnych eksperymentów, w tym klonowania, transfekcji, ekspresji białek na bazie komórek, oczyszczania białek i oceny wiązania. Czas trwania tych procedur waha się od tygodni do miesięcy. Ponadto procedury te często wykazują niską skuteczność w identyfikowaniu silnych przeciwciał neutralizujących przeciwko SARS-CoV-2.
W bieżącym badaniu naukowcy opracowali zautomatyzowaną platformę do wykrywania przeciwciał, która łączy bezkomórkową syntezę białek z wysokoprzepustowym testem interakcji białko-białko.
Platforma do wykrywania przeciwciał o wysokiej przepustowości
Platforma łączy cztery główne etapy, w tym składanie i amplifikację bezkomórkowego DNA, bezkomórkową syntezę białek, amplifikowany i jednorodny test immunosorbentu oraz zautomatyzowany przepływ pracy przy użyciu robotów i płynów dźwiękowych. Zastosowane w badaniu systemy bezkomórkowej syntezy białek mogą generować przeciwciała bezpośrednio z liniowych matryc DNA. Podobnie, test immunologiczny może szybko scharakteryzować oddziaływanie białko-białko bez potrzeby oczyszczania białka.
Platforma zajmuje tylko 24 godziny, aby przeszukać i rozróżnić setki przeciwciał związanych z określonym antygenem. W celu walidacji funkcjonalnej naukowcy wykorzystali tę zautomatyzowaną platformę do badań przesiewowych do przetestowania panelu 120 wcześniej zidentyfikowanych przeciwciał ukierunkowanych na białko szkieletowe SARS-CoV-2.
Przepływ pracy z wysokowydajnym, wolnym od komórek testem przeciwciał. a, Schematyczny diagram etapów związanych z przepływem pracy w teście przeciwciał bezkomórkowych. b, Schemat badania przesiewowego AlphaLISA pod kątem przeciwciał neutralizujących przez współzawodnictwo z ACE2 SARS-CoV-2 RBD. c, Ocena komercyjnych przeciwciał neutralizujących (nAb) w przesiewie kompetycyjnym AlphaLISA ACE2 (n = 3 niezależne powtórzenia ± SEM). d, Porównanie zgłaszanej i mierzonej skuteczności komercyjnych przeciwciał neutralizujących.
Wykrywanie interakcji białko-białko za pomocą wysokowydajnej platformy do wykrywania przeciwciał
Zdolność wiązania przeciwciał-kandydatów wytworzonych przy użyciu systemów bezkomórkowych oceniono za pomocą niemal luminescencyjnego, amplifikowanego testu immunosorpcyjnego. Wysokowydajna metoda przesiewowa pozwala odróżnić interakcje białko-białko bezpośrednio od interakcji bezkomórkowej syntezy białek. Ponadto metoda niekowalencyjna stabilizuje białka będące przedmiotem zainteresowania na perełkach donora i akceptora, które po oddziaływaniach wytwarzają sygnał chemiluminescencyjny. Co ważne, technika ta może scharakteryzować bezpośrednie wiązanie antygenu, jak również konkurencyjne wiązanie specyficznych epitopów.
Analiza pięciu dostępnych na rynku przeciwciał ujawniła, że ten test immunologiczny może określić zdolność przeciwciał do konkurowania z enzymem konwertującym angiotensynę 2 (ACE2) o wiązanie z domeną wiążącą RBD SARS-CoV-2. Dodatkowe testy z ciężkimi i lekkimi łańcuchami fragmentu wiążącego antygen wykazały, że test jest bardzo spójny w przewidywaniu agregacji przeciwciał.
Skuteczność testu immunologicznego w charakteryzowaniu wiązania przeciwciała oceniano przy użyciu różnych paneli przeciwciał, o których wiadomo, że wiążą się z trymerem kolców, kolcem RBD lub rywalizują z ACE2 o wiązanie RBD. Eksperymenty te obejmowały zestaw 120 przeciwciał, które zostały już zidentyfikowane i przetestowane.
Wyniki ujawniły, że amplifikowany, luminescencyjny, zbliżeniowy, homodimeryczny test immunosorpcyjny jest wysoce skuteczny w specyficznym wykrywaniu przeciwciał, które wiążą się z segmentami przycinania kolców, kolcami RBD lub konkurują z ACE2 o wiązanie RBD.
Ponieważ ponad 90% przeciwciał neutralizujących działa poprzez blokowanie interakcji ACE2-RBD, w badaniu porównano współzawodnictwo ACE2 z neutralizacją wirusa. Wyniki wykazały, że test może konsekwentnie identyfikować silne przeciwciała neutralizujące dzięki mechanizmowi blokowania ACE2, jednak test wykazał niską skuteczność w charakteryzowaniu słabszych przeciwciał neutralizujących.
Wydajność przepływu pracy w teście przeciwciał bezkomórkowych oceniono na neutralizujących przeciwciałach SARS-CoV-2. af, dane AlphaLISA przedstawiono jako średnie dla 3 niezależnych powtórzeń. Linia przerywana wskazuje trzy odchylenia standardowe od sygnału tła. ab, wcześniej opublikowaną mapę cieplną wiązania przeciwciała zmierzono za pomocą AlphaLISA w celu wykrycia wiązania trimeru S (skala log10), wiązania RBD (skala log10) i konkurencji ACE2 (skala liniowa). Dane AlphaLISA są prezentowane jako średnia z trzech niezależnych powtórzeń. Wykreślono również najniższą wartość IC neutralizacji zgłoszoną do porównania (skala log10), a X wskazuje na brak istotnych danych (tabela uzupełniająca 2). Mapa cieplna wiązania 36 różnych przeciwciał. b, Mapa cieplna wiązania wszystkich 84 przeciwciał w Brouwer et al. zbiór danych. cd, wykresy równoważności porównujące AlphaLISA z 84 przeciwciałami znalezionymi w Brouwer et al. Zestaw danych a opublikowane dane ELISA. Linia przerywana wskazuje trzy odchylenia standardowe od tła. c, oprawa trymera S. d, wiązanie RBD. e, Porównanie danych wiązania pomiędzy trimerem S i RBD AlphaLISA. f, Wykres równoważności porównujący dane konkurencji AlphaLISA ACE2 dla 84 przeciwciał w Brouwer et al. Zestaw danych a opublikowane dane neutralizacji pseudowirusów. Przeciwciała, o których doniesiono, że konkurują z ACE2 przez Brouwer et al. W kolorze czerwonym.
Przestudiuj znaczenie
Badanie opisuje rozwój i walidację wysokowydajnej zautomatyzowanej platformy do wykrywania przeciwciał, która wykorzystuje bezkomórkowe systemy testowe i ekspresyjne. Główną zaletą platformy jest szybki czas reakcji i wydajność. Na przykład pojedynczy badacz może scharakteryzować grupę 120 przeciwciał w ciągu 24 godzin przy użyciu tej metody.
Inną ważną cechą jest bezpośrednie profilowanie złożonych przeciwciał przy użyciu bezkomórkowych ekstraktów. Eliminuje to potrzebę procedur oczyszczania białek, które często stanowią etap definiujący w badaniach przesiewowych przeciwciał.
Jak donoszą naukowcy, ta wysokowydajna platforma może być wykorzystywana do szybkiej i łatwej identyfikacji silnych przeciwciał do zastosowań terapeutycznych, diagnostycznych i innych istotnych zastosowań badawczych.
„Odkrywca. Entuzjasta muzyki. Fan kawy. Specjalista od sieci. Miłośnik zombie.”
More Stories
Nowy raport WHO pokazuje, jak miasta przyczyniają się do postępu w zapobieganiu chorobom niezakaźnym i urazom
Naukowcy identyfikują „najlepszy punkt” bezpiecznej operacji po zawale serca
Badanie wykazało, że 20% dzieci chorych na zapalenie płuc nie otrzymuje antybiotyków